Năm 1994, người điều hành hãng xe Aprilia là Sandroni đã mời Valentino Rossi đến để thử cải thiện chiếc xe mới RS125R. Đầu tiên với sự giúp đỡ của Sandroni, Valentino đã giành chiến thắng tại giải Vô địch Italy 1994 và làm một điều tương tự vào năm 1995 khi đua ở cả hai giải là Vô địch Italy và Vô địch châu Âu.

Năm 1996 là một mùa giải tệ hại của Rossi, không những anh về hạng 5 mà anh còn bị tai nạn nữa. Mặc dù vậy, anh vẫn giành chiến thắng tại giải World Championship Grand Prix vào tháng 8/1996, ở Brno (Cộng Hòa Czech), với người bạn đồng hành là chiếc AGV Aprilia RS125R.

Anh đã kết thúc mùa giải 125cc World Championship thứ 9 với chiến thắng tuyệt đối 11 lần thắng/ 15 lần đua.

Năm 1998, chiếc Aprilia RS250 được ra mắt, và đội đua của Aprilia bao gồm Valentino Rossi, Loris Capirossi và Tetsuya Harada. Nhưng cũng năm đó, cái chết do tai nạn của 2 người bạn thân khiến Rossi mất hẳn phong độ thi đấu, và anh chỉ về thứ 2 (thua Capirossi 3 điểm).

Năm 1999, Rossi lại 1 lần nữa lên ngôi khi giành được 5 pole và 9 lần về nhất ở giải đua 250cc World Championship.

Rossi trở lại vào năm 2000, khi đó anh đua lần cuối cho hãng Aprilia ở hạng xe 250cc và vô địch giải đấu 250cc World Championship. Kết thúc mùa giải đó, anh chia tay với hãng Aprilla để đến với 1 vị trí cao hơn (500cc).

Cuối năm 2000, Rossi được Honda mời đến tham dự buổi ra mắt chiếc xe NSR500 và đội trưởng đội đua Honda là Jeremy Burgess đã ngỏ ý mời anh hợp tác với đội đua Honda, khi tay đua danh tiếng Michael Doohan vừa nghỉ hưu.

Anh đã khởi đầu một năm mới với đội đua đến từ nước Nhật, năm đầu tiên anh hợp tác với 1 hãng xe ngoài Italy. Trong đội đua này cũng có một người đồng hương của anh là Max Biaggi, tay đua ít có danh tiếng.

Rossi đã mang đến tiếng tăm lẫy lừng cho đội Honda, giống như ở giải 125cc và 250cc, Rossi đã về nhất 9 lần, và đẩy tay đua người Mỹ Kenny Roberts Jr. xuống hạng nhì ở giải 500cc World Championship.

Rossi chiến thắng giải 500cc World Championship vào năm 2001, với 11 lần về nhất. Cuối năm 2001, Rossi đã chia tay với giải 500cc để đến với hạng 990cc cũng của Honda.

Cũng vào năm 2001, Rossi lần đầu tiên chạy thử chiếc xe 4 thì 990cc Honda VTR1000SPW, anh đã hợp thành 1 đội với tay đua người Mỹ Colin Edwards - người từng đua cho đội Suzuki 8 Hours. Và vào năm 2002, anh đã giành chức vô địch MotoGP lần đầu tiên với chiếc siêu xe 990cc.